CRISPR载体上Cas9与Puro／GFP之间为什么要插入P2A序列？

为了实现Cas9在细胞中的表达，科研工作者把可以表达Cas9的质粒转染入细胞。当然，蛋白质印迹和免疫组化等实验可以检测Cas9在细胞中是否成功表达，但是这些检测手段都相对滞后且不

为了实现Cas9在细胞中的表达，科研工作者把可以表达Cas9的质粒转染入细胞。当然，蛋白质印迹和免疫组化等实验可以检测Cas9在细胞中是否成功表达，但是这些检测手段都相对滞后且不够直观。Puro/GEP与Cas9的共表达可以很好地解决这一问题，我们可以通过Puro/GEP的表达情况获取Cas9的表达信息。上世纪80年代开始，科研工作者开始探索使蛋白共表达的方法，陆续发现并使用的有多启动子表达载体、剪切载体、插入蛋白酶切位点、插入IRES等方法。用这些方法构建的转染质粒大多较大，转染效率低且转染后不同蛋白的表达效率差异很大。上世纪80年代开始，科研工作者发现在小核糖核酸病毒中存在一种快速的多蛋白共表达现象。很快人们发现在这其中扮演重要作用的是一段仅有18-22个氨基酸的2A多肽。在2A多肽的翻译过程中，它会和核糖体的出口通道相互作用，诱导 “跳过”其C末端的最后一个肽键，然后核糖体能够在释放后继续翻译下游的基因。这种翻译机制可以使Cas9和Puro/GEP共表达的同时自然地被“切开”，可以同时表达但不影响相互的功能。

现在已发现的并广泛应用于生物功能研究的2A多肽有口蹄疫病毒2A多肽(foot-and-mouth disease virus ,F2A)、马鼻炎A病毒2A多肽(equine rhinitis A virus，E2A)、猪捷申病毒2A多肽( porcine teschovirus-1,P2A) 以及明脉扁刺蛾β四体病毒2A多肽(Thosea asigna virus ,T2A)。不同的2A多肽对共表达蛋白的“切割”效率不同。有研究表明，体外实验中T2A的切割效率最好；体内实验中(如在人类细胞系、斑马鱼、小鼠中)P2A的切割效率最好。